薄層色譜法實(shí)驗(yàn)操作方法

薄層色譜法實(shí)驗(yàn)流程

薄層色譜法系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上，在展開(kāi)容器內(nèi)用展開(kāi)劑展開(kāi)，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按同法所得的色譜圖對(duì)比，亦可用薄層色譜掃描儀進(jìn)行掃描，用于鑒別、檢查或含量測(cè)定。

1.儀器與材料

（1）薄層板  按支持物的材質(zhì)分為玻璃板、塑料板或鋁板等；按固定相種類(lèi)分為硅膠薄層板、鍵合硅膠板、微晶纖維素薄層板、聚酰胺薄層板、氧化鋁薄層板等。固定相中可加入黏合劑、熒光劑。硅膠薄層板常用的有硅膠 G、硅膠 GF254、硅膠 H、硅膠 HF254，G、H 表示含或不含石膏黏合劑，F(xiàn)254 為在紫外光 254nm 波長(zhǎng)到紫外線(xiàn)燈下顯綠色背景的熒光劑。按固定相粒徑大小分為普通薄層板（10~40μm）和高效薄層板（5~10μm）。

　　在保證色譜質(zhì)量的前提下，可對(duì)薄層板進(jìn)行特別處理和化學(xué)改性以適應(yīng)分離的要求，可用實(shí)驗(yàn)室自制的薄層板。固定相顆粒大小一般要求粒徑為 10~40μm。玻板應(yīng)光滑、平整，洗凈后不附水珠。

　?。?）點(diǎn)樣器  一般釆用微升毛細(xì)管或手動(dòng)、半自動(dòng)、全自動(dòng)點(diǎn)樣器材。

　?。?）展開(kāi)容器  上行展開(kāi)一般可用適合薄層板大小的專(zhuān)用平底或雙槽展開(kāi)缸，展開(kāi)時(shí)須能密閉。水平展開(kāi)用專(zhuān)用的水平展開(kāi)槽。

　?。?）顯色裝置  噴霧顯色應(yīng)使用玻璃噴霧瓶或?qū)Ｓ脟婌F器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細(xì)霧狀噴出；浸漬顯色可用專(zhuān)用玻璃器械或用適宜的展開(kāi)缸代用；蒸氣熏蒸顯色可用雙槽展開(kāi)缸或適宜大小的干燥器代替。

　?。?）檢視裝置  為裝有可見(jiàn)光、254nm 及 365nm 紫外光光源及相應(yīng)的濾光片的紫外觀(guān)察箱，可附加攝像設(shè)備供拍攝圖像用。紫外觀(guān)察箱暗箱內(nèi)光源應(yīng)有足夠的光照度。

　?。?）薄層色譜掃描儀  系指用一定波長(zhǎng)的光對(duì)薄層板上有吸收的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)，進(jìn)行掃描，將掃描得到的譜圖和積分?jǐn)?shù)據(jù)用于物質(zhì)定性或定量的分析儀器。

用于薄層色譜的紫外觀(guān)察箱、薄層分析用紫外線(xiàn)燈箱

薄層色譜法操作方法

　?。?）薄層板制備

　　市售薄層板  臨用前一般應(yīng)在 110℃ 活化 30 分鐘。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板、塑料薄層板可根據(jù)需要剪裁，但須注意剪裁后的薄層板底邊的固定相層不得有破損。如在存放期間被空氣中雜質(zhì)污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶劑在展開(kāi)缸中上行展開(kāi)預(yù)洗，晾干，110℃ 活化，置干燥器中備用。

　　自制薄層板  除另有規(guī)定外，將 1 份固定相和 3 份水（或加有黏合劑的水溶液，如 0.2%~0.5%羥甲基纖維素鈉水溶液，或?yàn)橐?guī)定濃度的改性劑溶液）在研缽中按同一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地移動(dòng)涂布器進(jìn)行涂布（厚度為 0.2~0.3mm），取下涂好薄層的玻板，置水平臺(tái)上于室溫下晾干后，在 110℃ 烘 30 分鐘，隨即置于有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度，在反射光及透視光下檢視，表面應(yīng)均勻、平整、光滑，并且無(wú)麻點(diǎn)、無(wú)氣泡、無(wú)破損及污染。

　?。?）點(diǎn)樣  除另有規(guī)定外，在潔凈干燥的環(huán)境中，用專(zhuān)用毛細(xì)管或配合相應(yīng)的半自動(dòng)、自動(dòng)點(diǎn)樣器械點(diǎn)樣于薄層板上。一般為圓點(diǎn)狀或窄細(xì)的條帶狀，點(diǎn)樣基線(xiàn)距底邊 10~15mm，高效板一般基線(xiàn)離底邊 8~10mm。圓點(diǎn)狀直徑一般不大于 4mm，高效板一般不大于 2mm。接觸點(diǎn)樣時(shí)注意勿損傷薄層表面。條帶狀寬度一般為 5~10mm，高效板條帶寬度一般為 4~8mm，可用專(zhuān)用半自動(dòng)或自動(dòng)點(diǎn)樣器械噴霧法點(diǎn)樣。點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以相鄰斑點(diǎn)互不干擾為宜，一般不少于 8mm，高效板供試品間隔不少于 5mm。

　?。?）展開(kāi)  將點(diǎn)好供試品的薄層板放入展開(kāi)缸中，浸入展開(kāi)劑的深度為距原點(diǎn) 5mm 為宜，密閉。除另有規(guī)定外，一般上行展開(kāi) 8~15cm，高效薄層板上行展開(kāi) 5~8cm。溶劑前沿達(dá)到規(guī)定的展距，取出薄層板，晾干，待檢測(cè)。

　　展開(kāi)前如需要溶劑蒸氣預(yù)平衡，可在展開(kāi)缸中加入適量的展開(kāi)劑，密閉，一般保持 15~30 分鐘。溶劑蒸氣預(yù)平衡后，應(yīng)迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開(kāi)。如需使展開(kāi)缸達(dá)到溶劑蒸氣飽和的狀態(tài)，則須在展開(kāi)缸的內(nèi)壁貼與展開(kāi)缸高、寬同樣大小的濾紙，一端浸入展開(kāi)劑中，密閉一定時(shí)間，使溶劑蒸氣達(dá)到飽和再如法展開(kāi)。

　　必要時(shí)，可進(jìn)行二次展開(kāi)或雙向展開(kāi)，進(jìn)行第二次展開(kāi)前，應(yīng)使薄層板殘留的展開(kāi)劑完全揮干。

　　（4）顯色與檢視  有顏色的物質(zhì)可在可見(jiàn)光下直接檢視，無(wú)色物質(zhì)可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色，或加熱顯色，在可見(jiàn)光下檢視。有熒光的物質(zhì)或顯色后可激發(fā)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可在紫外線(xiàn)燈（365nm 或 254nm）下觀(guān)察熒光斑點(diǎn)。對(duì)于在紫外光下有吸收的成分，可用帶有熒光劑的薄層板（如硅膠 GF254 板），在紫外光燈（254nm）下觀(guān)察熒光板面上的熒光物質(zhì)淬滅形成的斑點(diǎn)。

　?。?）記錄  薄層色譜圖像一般可采用攝像設(shè)備拍攝，以光學(xué)照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層色譜掃描儀掃描或其他適宜的方式記錄相應(yīng)的色譜圖。

　　3.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

　　按各品種項(xiàng)下要求對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，即用供試品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)符合規(guī)定的要求。

　?。?）比移值（Rf）  系指從基線(xiàn)至展開(kāi)斑點(diǎn)中心的距離與從基線(xiàn)至展開(kāi)劑前沿的距離的比值。

　　除另有規(guī)定外，雜質(zhì)檢查時(shí)，各雜質(zhì)斑點(diǎn)的比移值 Rf 以在 0.2~0.8 之間為宜。

　　（2）檢出限  系指限量檢查或雜質(zhì)檢查時(shí)，供試品溶液中被測(cè)物質(zhì)能被檢出的低濃度或量。一般采用已知濃度的供試品溶液或?qū)φ諛?biāo)準(zhǔn)溶液，與稀釋若干倍的自身對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液在規(guī)定的色譜條件下，在同一薄層板上點(diǎn)樣、展開(kāi)、檢視，后者顯清晰可辨斑點(diǎn)的濃度或量作為檢出限。

　?。?）分離度（或稱(chēng)分離效能）  鑒別時(shí)，供試品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜中的斑點(diǎn)均應(yīng)清晰分離。當(dāng)薄層色譜掃描法用于限量檢查和含量測(cè)定時(shí)，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度(R)的計(jì)算公式為：

　　R=2(d2-d1)/(W1+W2)

　　式中 d2 為相鄰兩峰中后一峰與原點(diǎn)的距離；

　　d1 為相鄰兩峰中前一峰與原點(diǎn)的距離；

　　W1 及 W2 為相鄰兩峰各自的峰寬。

　　除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于 1.0。

　　在化學(xué)藥品雜質(zhì)檢查的方法選擇時(shí)，可將雜質(zhì)對(duì)照品用供試品自身稀釋的對(duì)照溶液溶解制成混合對(duì)照溶液，也可將雜質(zhì)對(duì)照品用待測(cè)組分的對(duì)照品溶液溶解制成混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，還可釆用供試品以適當(dāng)?shù)慕到夥椒ǐ@得的溶液，上述溶液點(diǎn)樣展開(kāi)后的色譜圖中，應(yīng)顯示清晰分離的斑點(diǎn)。

　?。?）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差  薄層掃描含量測(cè)定時(shí)，同一供試品溶液在同一薄層板上平行點(diǎn)樣的待測(cè)成分的峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于 5.0%；需顯色后測(cè)定的或者異板的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于 10.0%。

　　4.測(cè)定法

　?。?）鑒別  按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一薄層板上點(diǎn)樣、展開(kāi)與檢視，供試品色譜圖中所顯斑點(diǎn)的位置和顏色（或熒光）應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖的斑點(diǎn)一致。必要時(shí)化學(xué)藥品可采用供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液混合點(diǎn)樣、展開(kāi)，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相應(yīng)斑點(diǎn)應(yīng)為單一、緊密斑點(diǎn)。

　?。?）限量檢查與雜質(zhì)檢查  按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按規(guī)定的色譜條件點(diǎn)樣、展開(kāi)和檢視。供試品溶液色譜圖中待檢查的斑點(diǎn)與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)斑點(diǎn)比較，顏色（或熒光）不得更深；或照薄層色譜掃描法操作，測(cè)定峰面積值，供試品色譜圖中相應(yīng)斑點(diǎn)的峰面積值不得大于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積值。含量限度檢查應(yīng)按規(guī)定測(cè)定限量。

　　化學(xué)藥品雜質(zhì)檢查可釆用雜質(zhì)對(duì)照法、供試品溶液的自身稀釋對(duì)照法或兩法并用。供試品溶液除主斑點(diǎn)外的其他斑點(diǎn)與相應(yīng)的雜質(zhì)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液或系列濃度雜質(zhì)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液的相應(yīng)主斑點(diǎn)比較，不得更深，或與供試品溶液自身稀釋對(duì)照溶液或系列濃度自身稀釋對(duì)照溶液的相應(yīng)主斑點(diǎn)比較，不得更深。通常應(yīng)規(guī)定雜質(zhì)的斑點(diǎn)數(shù)和單一雜質(zhì)量，當(dāng)釆用系列自身稀釋對(duì)照溶液時(shí)，也可規(guī)定估計(jì)的雜質(zhì)總量。

　?。?）含量測(cè)定  照薄層色譜掃描法，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按規(guī)定的色譜條件點(diǎn)樣、展開(kāi)、掃描測(cè)定?；?qū)⒋郎y(cè)色譜斑點(diǎn)刮下經(jīng)洗脫后，再用適宜的方法測(cè)定。

5.薄層色譜掃描法

　　系指用一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中可吸收紫外光或可見(jiàn)光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)用于鑒別、檢查或含量測(cè)定?？筛鶕?jù)不同薄層色譜掃描儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，按照規(guī)定方式掃描測(cè)定，一般選擇反射方式，采用吸收法或熒光法。除另有規(guī)定外，含量測(cè)定應(yīng)使用市售薄層板。

　　掃描方法可采用單波長(zhǎng)掃描或雙波長(zhǎng)掃描。如采用雙波長(zhǎng)掃描，應(yīng)選用待測(cè)斑點(diǎn)無(wú)吸收或小吸收的波長(zhǎng)為參比波長(zhǎng)，供試品色譜圖中待測(cè)斑點(diǎn)的比移值（Rf 值）、光譜掃描得到的吸收光譜圖或測(cè)得的光譜大吸收和小吸收應(yīng)與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液相符，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。薄層色譜掃描定量測(cè)定應(yīng)保證供試品斑點(diǎn)的量在線(xiàn)性范圍內(nèi)，必要時(shí)可適當(dāng)調(diào)整供試品溶液的點(diǎn)樣量，供試品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同板點(diǎn)樣、展開(kāi)、掃描、測(cè)定和計(jì)算。

　　薄層色譜掃描用于含量測(cè)定時(shí)，通常采用線(xiàn)性回歸二點(diǎn)法計(jì)算，如線(xiàn)性范圍很窄時(shí)，可用多點(diǎn)法校正多項(xiàng)式回歸計(jì)算。供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)交叉點(diǎn)于同一薄層板上，供試品點(diǎn)樣不得少于 2 個(gè)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)每一濃度不得少于 2 個(gè)。掃描時(shí)，應(yīng)沿展開(kāi)方向掃描，不可橫向掃描。

上圖：用于薄層色譜的雙波長(zhǎng)紫外線(xiàn)燈LEAC-280L