細(xì)胞光毒性試驗原理和實驗步驟

為什么要對藥物進行光毒性試驗？

>雖然許多藥物和日化用品對人體不會造成直接的傷害，但在紫外線的作用下，例如日光照射、紫外環(huán)境下操作條件下便會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而引發(fā)皮膚過敏癥或者其他形式的傷害，專業(yè)上稱之為化學(xué)品具有的光毒性傷害。對此類化學(xué)制品進行光毒性檢測實驗可以預(yù)防和減輕這類光毒性給我們帶來的不利影響。

LUYOR-3450細(xì)胞光毒性輻照儀克服了現(xiàn)有的光毒性鑒定實驗設(shè)施所用的光源不純， 實驗效率低下，而且實驗條件惡劣，操作人員不安全。LUYOR-3450可以準(zhǔn)確控制實驗精度、安全、方便、高效的紫外輻照儀。

細(xì)胞光毒性試驗原理

細(xì)胞光毒性是指應(yīng)用于機體的物質(zhì)經(jīng)暴露于光線后誘發(fā)或增強（在低劑量水平時明顯）的毒性反應(yīng)，或全身應(yīng)用一種物質(zhì)后由皮膚光照引起的反應(yīng)。中性紅是一種弱的陽離子染料，極易以非離子擴散的方式穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞溶酶體內(nèi)聚集。某些化學(xué)物質(zhì)和外界條件作用可引起細(xì)胞表面或溶酶體膜敏感性的改變導(dǎo)致溶酶體脆性增高等不可逆的細(xì)胞毒性變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞吸收中性紅的能力下降。

本試驗方法通過測定3T3成纖維細(xì)胞經(jīng)化學(xué)物質(zhì)和紫外線照射聯(lián)合作用后細(xì)胞吸收中性紅的能力或細(xì)胞毒性的變化來判斷該化學(xué)物質(zhì)是否具有光毒性。

細(xì)胞光毒性試驗材料與試劑

（一）光源類型

選擇合適的光源必須符合的標(biāo)準(zhǔn)包括：光源發(fā)射的光波長能被受試物吸收（吸收光譜），光的劑量（在一個合理的暴露時間內(nèi)能達到的劑量）能滿足已知光毒性化學(xué)物質(zhì)的檢測。此外的波長和劑量不能有損于試驗系統(tǒng)，如（紅外區(qū)域）熱量散發(fā)或類似UVB波長的高細(xì)胞毒性的干擾，因此光源要求能夠穩(wěn)定地釋放UVA和可見光波長，推薦使用LUYOR-3450細(xì)胞光毒性輻照儀。

由于的太陽光模擬器都發(fā)射出相當(dāng)數(shù)量的UVB，應(yīng)經(jīng)過適當(dāng)?shù)倪^濾使UVB＜0.1J/cm2。透過96孔組織培養(yǎng)板蓋的光強度建議為1.7mW/cm2光強度（即5J/cm2）劑量。

（二）細(xì)胞株

選用永生化小鼠成纖維細(xì)胞系—Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞。要求細(xì)胞來源必須是具有公信力的機構(gòu)且能確保細(xì)胞品質(zhì)穩(wěn)定。

由于細(xì)胞對UVA的敏感性隨傳代數(shù)的增加可能增高，建議用于試驗的Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞傳代次數(shù)好少于100次。

測試單位若自行培養(yǎng)細(xì)胞株，則須定期檢測細(xì)胞株對UV光的敏感性，并確保無支原體污染。

（三）培養(yǎng)基

采用DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清或小牛血清（10%）、谷氨酰胺（4mmol/L）、抗生素（青霉素和鏈霉素，濃度分別為100IU和100μg/mL），在36.5℃—37.5℃, 5%—7.5%CO2條件下培養(yǎng)。

（四）溶劑的選擇

在測定前，應(yīng)首先評價受試物的溶解度，以選擇佳溶劑體系。溶劑必須不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響細(xì)胞活性。

能溶于水且濃度達1000μg/mL的受試物可溶于預(yù)先加溫（37℃）和滅菌的磷酸鹽緩沖液（EBSS或PBS）。水中溶解度有限的受試物（＜1000μg/mL）可用二甲基亞砜（DMSO）或乙醇（ETOH）等溶劑溶解。使用DMSO或ETOH作為溶劑時，其終濃度不得超過總體積的1%（v/v），陰性對照組和受試物組溶劑的體積比例應(yīng)相同。

（五）受試物的配制

受試物必須在使用前新鮮配制。建議的化學(xué)物質(zhì)操作和細(xì)胞處理初期都應(yīng)避免受試物在光激活或光降解的光線條件下進行。

每次實驗應(yīng)設(shè)空白對照、溶劑對照和陽性對照（推薦使用氯丙嗪）。加樣示意圖見附錄B。

（六）受試物劑量的設(shè)置

需通過預(yù)實驗確定有光照和無光照條件下受試物的濃度范圍。用溶劑將受試物原液使用同一常數(shù)稀釋因子（如 ＝3.16）稀釋成8個濃度，相關(guān)濃度范圍應(yīng)包括從大細(xì)胞毒性至幾乎無細(xì)胞毒性濃度（細(xì)胞存活率在20%—的范圍）。

如果預(yù)實驗結(jié)果表明在濃度等于1000μg/mL時仍未出現(xiàn)細(xì)胞毒性，則建議高濃度為1000μg/mL；若出現(xiàn)細(xì)胞毒性的濃度低于1000μg/mL時，有細(xì)胞毒性的濃度少于三種，則需要進行重復(fù)試驗或使用更小的稀釋因子，直至出現(xiàn)有細(xì)胞毒性的濃度至少三種。如果根據(jù)受試物的溶解度，高濃度不能達到1000μg/mL，則以大溶解度時的濃度作為高濃度，避免受試物在任何濃度出現(xiàn)沉淀。

如果在無光照條件下(-Irr)受試物在高濃度時仍然不具有細(xì)胞毒性，而在有光照條件下(+Irr)出現(xiàn)強烈細(xì)胞毒性，則在-Irr試驗和+Irr試驗中可采用不同的試驗濃度。

（七）中性紅（Neutral Red，NR）

化學(xué)名為3-氨基一7一二甲氨基一2一甲基吩嗪鹽酸鹽(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride)，CAS編號:553-24-2；或藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，編號：100460。

（八）中性紅溶液

1．中性紅原液。稱取0.4g中性紅染料，溶于100mL蒸餾水（室溫條件下可保存2個月）

2．中性紅使用液。在79mL DMEM培養(yǎng)液中加入1mL中性紅原液，即為使用液。中性紅終濃度為50μg/mL。

（九）中性紅解吸附溶液

將蒸餾水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制（現(xiàn)用現(xiàn)配，儲存不超過1小時）。

細(xì)胞光毒性試驗步驟

（一）加100μL培養(yǎng)基于96孔組織培養(yǎng)板的外圍孔（空白對照），在其余孔中加入100μL密度為1×105個細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液（即1×104細(xì)胞/孔）。每次試驗制備兩個板，包括相同的受試物濃度系列、溶劑對照、空白對照和陽性對照，一個板用于確定細(xì)胞毒性（-Irr），另一個板用于確定光毒性（+Irr）。

（二）培養(yǎng)細(xì)胞24小時（5%—7.5%CO2，37℃）直至它們形成單層半飽和細(xì)胞。該培養(yǎng)過程允許細(xì)胞恢復(fù)和粘連。

（三）去除培養(yǎng)液，用150μL EBSS或PBS輕柔沖洗細(xì)胞一次或兩次。加入100μL含適當(dāng)濃度受試物或溶劑的緩沖液到孔中。培養(yǎng)細(xì)胞1小時（5%—7.5%CO2，37℃）。

（四）在室溫下將其中一個板放入LUYOR-3450細(xì)胞光毒性輻照儀的輻照腔內(nèi)進行光照（+Irr）暴露，以1.7mW/cm2光強度透過96孔板蓋照射細(xì)胞50分鐘；同時將另一個平板無光照（-Irr）置于暗盒內(nèi)50分鐘。

（五）去除受試溶液，用150μL EBSS或PBS仔細(xì)沖洗細(xì)胞兩次。加入100μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)過夜（18—22小時，5%—7.5%CO2，37℃）。

（六）在相差顯微鏡下檢查細(xì)胞，記錄受試物細(xì)胞毒性所致細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，用于排除試驗誤差。

（七）中性紅吸收（NRU）測量。細(xì)胞吸收中性紅進入溶酶體和活細(xì)胞體內(nèi)空泡，可用作細(xì)胞數(shù)量和活性的定量指標(biāo)。

1．用150μL預(yù)溫的EBSS或PBS沖洗細(xì)胞一次或兩次。輕柔拍打平板，去除沖洗溶液。加入100μL含50μg/mL中性紅的培養(yǎng)液，在5%—7.5%CO2，37℃和濕度適宜的環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞3小時。

2．去除中性紅培養(yǎng)液，用150μL EBSS或PBS沖洗細(xì)胞一次或兩次。

3．輕輕倒出并吸干全部EBSS或PBS。

4．準(zhǔn)確加入150μL中性紅解吸附溶液。

5．在微量滴定平板振蕩器上震蕩96孔板10分鐘，直至中性紅從細(xì)胞內(nèi)被提取出來，并形成均勻溶液。

6．用分光光度計或酶標(biāo)儀測定中性紅提取物溶液在540nm波長處的光密度。用空白孔作為參考對照。

七、結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)

（一）確定以光刺激因子（PIF值）為基礎(chǔ)的預(yù)測模型

1．通過分析在有光照（+Irr）和無光照（-Irr）兩種情況下獲得的細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線，確定能抑制50%細(xì)胞活性的受試物濃度（IC50），按下列公式計算光刺激因子（PIF）。

PIF＝IC50（-Irr）

IC50（+Irr）

評判標(biāo)準(zhǔn)：PIF≤2：預(yù)測“無光毒性”；PIF≥5：預(yù)測“有光毒性”。PIF介于2—5之間，需進行重復(fù)試驗；如果PIF仍介于2—5之間，預(yù)測“有潛在光毒性”。

2．如果受試物在有光照（+Irr）時有細(xì)胞毒性，無光照（-Irr）時無細(xì)胞毒性，且細(xì)胞毒性試驗所使用的濃度已達高受試濃度（Cmax）時，可按照下列公式計算＞PIF：

＞PIF＝Cmax（-Irr）/ IC50（+Irr）

評判標(biāo)準(zhǔn)為：如果只獲得一個“＞PIF”，那么任何＞PIF ＞1的值都能提示“有潛在光毒性”。

3．受試物在高濃度時仍未顯示任何細(xì)胞毒性，用“PIF＝*1”表示，提示“無潛在光毒性”。

（二）確定以平均光效應(yīng)（MPE值）為基礎(chǔ)的預(yù)測模型

通過在濃度網(wǎng)格上比較有光照（+Irr）和無光照（-Irr）兩種情況下獲得的細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線（i＝1，….，N）可得到平均光效應(yīng)（MPE），細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線的染毒濃度需在有光照（+Irr）和無光照（-Irr）試驗共有的濃度范圍內(nèi)選擇。濃度Ci的光效應(yīng)（PEi）等于濃度效應(yīng)（CEi）和反應(yīng)效應(yīng)（REi）的乘積。使用專門的軟件“PHOTO32或更高版本”求得平均光效應(yīng)（MPE），建立以平均光效應(yīng)（MPE）為基礎(chǔ)的預(yù)測模型。通過將MPE與臨界閾值MPEc比較，預(yù)測化學(xué)物潛在光毒性的預(yù)測模型。

閾值MPEc＝0.1

評判標(biāo)準(zhǔn)：

如果MPE≤0.1：預(yù)測無潛在光毒性；

如果MPE≥0.15：預(yù)測有潛在光毒性。

如果MPE介于0.1—0.15之間，需進行重復(fù)實驗；如果MPE仍介于0.1—0.15之間，預(yù)測有潛在光毒性。

上圖：LUYOR-3450細(xì)胞光毒性輻照儀