熒光顯微鏡的原理和操作步驟

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熒光顯微鏡的原理是什么?

與普通光學(xué)顯微鏡不同，熒光顯微鏡不是通過普通光源的照射來觀察標(biāo)本，而是利用一定波長的光（通常是紫外光、藍(lán)紫光）在顯微鏡下激發(fā)標(biāo)本中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，所以，熒光顯微鏡光源的作用不是直接照射，而是作為能量源激發(fā)標(biāo)本內(nèi)部的熒光物質(zhì)。我們之所以能觀察到標(biāo)本，是由于光源的照射，而是標(biāo)本中的熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光能后呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。

由此可見，熒光顯微鏡的主要特點(diǎn)是它的光源可以在特定波長范圍內(nèi)提供大量的激發(fā)光，使被測樣品中的熒光物質(zhì)能夠獲得被測物的激發(fā)光。必要的強(qiáng)度。同時，熒光顯微鏡必須有相應(yīng)的濾光系統(tǒng)。

熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的重要工具。它由超高壓光源、濾光系統(tǒng)（包括激發(fā)和加壓濾板）、光學(xué)系統(tǒng)和照相系統(tǒng)等主要部件組成。它利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。

激發(fā)熒光的方式：根據(jù)光的波長范圍分為UV激發(fā)法（使用紫外照射法）和BV激發(fā)法（使用藍(lán)紫光）。紫外激發(fā)法使用短于 400 nm 的近紫外光進(jìn)行激發(fā)。該方法沒有可見的激發(fā)光，因此觀察到的熒光表現(xiàn)出染料的固有熒光，很容易區(qū)分標(biāo)本上的特異性熒光和背景組織的自發(fā)熒光。

BV激發(fā)法是從紫外光激發(fā)到以404nm和434nm為中心的藍(lán)光。這種方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本，因此熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用能夠完全阻擋藍(lán)光并完全通過所需的綠色和黃色熒光的濾光片。用于熒光抗體測定的熒光染料。激發(fā)光的*大吸收波長與熒光的*大發(fā)射波長比較接近，所以BV激發(fā)法中使用的濾光片必須使用銳截止濾光片。該方法可以使用藍(lán)光作為激發(fā)光，因此熒光染料的吸收效率高，可以獲得更亮的圖像。缺點(diǎn)是500nm以下看不到熒光，500nm以上會使整個圖像呈現(xiàn)黃色。在熒光抗體法中，大部分熒光染料都是獨(dú)特的。因此，在討論細(xì)微特異性時，上述 BV 激發(fā)方法的缺點(diǎn)往往影響很大。

綜上所述，熒光顯微鏡的照明根據(jù)聚光鏡的結(jié)構(gòu)和激發(fā)光的波長可以分為以下三點(diǎn)。

1.從熒光圖像的對比度要求來看，紫外激發(fā)的暗場聚光鏡*適合照明。

2.考慮到圖像的亮度，BV激發(fā)濾光片的暗場觀察效率*高。

3.UV激發(fā)濾光片暗場觀察和BV激發(fā)暗場聚光鏡照明的特點(diǎn)可以說是介于這兩種照明方式之間，但前者的濾光片暗場特性更強(qiáng)，顯示的圖像更亮，對比度小；后者保留了暗場光路的特性，因此顯示圖像更暗，對比度提高。實際使用熒光顯微鏡時，應(yīng)使用*適合標(biāo)本要求的照明方法進(jìn)行觀察。

必須指出的是，即使是用對比度*好的紫外激發(fā)暗場聚光器照射時，被試樣折射或散射的部分紫外激發(fā)光也會進(jìn)入物鏡，使加膠面和光學(xué)玻璃中的加膠面光學(xué)系統(tǒng)會受到激發(fā)的影響，產(chǎn)生的自發(fā)熒光會使圖像的響應(yīng)變差。因此，必須在目鏡前使用吸收紫外線的濾光片作為截止濾光片。

 熒光顯微鏡的基本操作步驟

1.安裝紫外線防護(hù)罩。

2.打開高壓汞燈電源控制箱開關(guān)。本文來自檢驗條網(wǎng)

3.插入遮光罩以中斷光路。

4.預(yù)熱5-10分鐘。

5.將載有樣品的載玻片放在載物臺上。

6.選擇物鏡（按先低倍，后高倍的順序）。

7.轉(zhuǎn)動分光鏡組件轉(zhuǎn)盤，選擇需要的分光鏡組件：“O”為觀察透射光； “WU”用于觀察藍(lán)色熒光（如DAP1）； “WB”用于觀察綠色熒光（如FITC）； “WG”用于觀察紅色熒光（如TRITC）。

8.使用阻塞濾光片（目前大多數(shù)阻塞濾光片都內(nèi)置在熒光顯微鏡中）。

9.通過粗細(xì)螺旋調(diào)節(jié)焦距。

10.打開連接顯微鏡的電腦，點(diǎn)擊數(shù)字成像系統(tǒng)軟件，采集數(shù)字圖像。

熒光顯微鏡的注意事項

1.由于熒光觀察所用的光源是高壓汞燈，發(fā)出的光中含有紫外線，對人眼有害，所以必須加裝紫外線防護(hù)罩。本文來自巡檢區(qū)網(wǎng)

2.為延長水銀燈的使用壽命，水銀燈打開后不能立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要15分鐘才能關(guān)閉。

3.水銀燈熄滅后，待完全冷卻后再重新啟動。否則，燈內(nèi)的水銀蒸氣還沒有恢復(fù)到液態(tài)，內(nèi)阻極小。如果再次施加電壓，會造成短路，導(dǎo)致汞燈爆炸。這不僅會損壞電器，更重要的是，汞蒸氣會溢出，從而導(dǎo)致工作室受到污染。因此，關(guān)閉水銀燈后，不能立即再次開啟，必須至少等待 30 分鐘。

4.高壓水銀燈工作時放出大量熱量。因此工作環(huán)境溫度不宜過高，必須有良好的散熱條件。

5.汞燈的使用壽命約為200-300小時。電源控制箱上有一個時間累積計數(shù)器。用戶需要記錄累計小時數(shù)，當(dāng)達(dá)到300小時時，需要更換新燈泡，否則亮度不夠，影響觀察。

熒光顯微鏡標(biāo)本制作特點(diǎn)及觀察要求

1.幻燈片：幻燈片的厚度應(yīng)該是0.在 8mm 到 1.2mm 之間，載玻片太厚，無法吸收更多的光，激發(fā)光難以聚集在標(biāo)本上。載玻片必須光滑、厚度均勻且沒有明顯的自發(fā)熒光。有時使用石英玻璃載玻片。

2.蓋板玻璃：蓋板玻璃的厚度應(yīng)在0.17mm左右，光滑、干凈。為了增強(qiáng)激發(fā)光，也可以使用干涉蓋玻片。這種特殊的蓋板玻璃表面鍍有幾層物質(zhì)（如氟化鎂），對不同波長的光有不同的干涉作用，可以使熒光順利通過和反射。激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光激發(fā)樣品中的熒光。

3.標(biāo)本：組織切片或其他標(biāo)本不宜太厚，一般5-20pm。太厚的切片會導(dǎo)致大部分激發(fā)光在試樣下部被消耗，而物鏡直接觀察到的試樣上部不能被激發(fā)。切片折疊或雜質(zhì)過多會影響熒光觀察。

4.封固劑：封固劑必須無自發(fā)熒光，五色透明。添加防淬火劑后，用指甲油（實際使用中，指甲油密封效果很好，可以薄而均勻）將蓋板玻璃密封在其周圍，這樣不僅可以防止蓋板玻璃滑動，還能防止抗衰老。猝滅劑蒸發(fā)。在沒有抗淬滅劑的情況下，也可以使用含30%甘油的PBS，或等量的甘油和0.5mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.0-9.5）的混合物封片。

5.鏡片的清潔：油性鏡片使用后，需要用無水乙醇或3：7酒精醚混合物擦拭鏡片紙。

6.及時觀察：染色后的標(biāo)本要及時觀察，因為時間長了熒光會逐漸減弱。如果將標(biāo)本存放在 4°C 的聚乙烯塑料袋中，可以延遲熒光衰減時間。