毛細(xì)管電泳的原理和優(yōu)勢(shì)

什么是毛細(xì)管電泳？

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)又叫效毛細(xì)管電泳(HPCE), 是近年來(lái)發(fā)展快的分析方法之。效毛細(xì)管電泳是類以毛細(xì)管為分離通道、以壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分析技術(shù)。毛細(xì)管電泳是將電泳的場(chǎng)所置于毛細(xì)管中的種電泳分離方法，它的裝置結(jié)構(gòu)通常由壓電源、鉑電、緩沖液池、樣品池、毛細(xì)管、檢測(cè)器和分析記錄儀構(gòu)成。

毛細(xì)管電泳的原理和過(guò)程是怎樣的？

毛細(xì)管電泳分離的基本流程有進(jìn)樣、分離和檢測(cè)三步驟。進(jìn)樣：毛細(xì)管電泳的基本裝置是根充滿電泳緩沖液的毛細(xì)管，與毛細(xì)管兩端相連的兩個(gè)小瓶微量樣品從毛細(xì)管的端通過(guò)“壓力”或“電遷移”進(jìn)入毛細(xì)管；分離：電泳時(shí)，與壓電源連接的兩個(gè)電分別浸人毛細(xì)管兩端小瓶的緩沖液中。樣品朝與自身所帶電荷性相反的電方向泳動(dòng)。各組分因其分子大小、所帶電荷數(shù)、等電點(diǎn)等性質(zhì)的不同而遷移速率不同，依次移動(dòng)至毛細(xì)管輸出端附近的光檢測(cè)器，檢測(cè)、記錄吸光度，并在屏幕上以遷移時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)將各組分以吸收峰的形式動(dòng)態(tài)直觀地記錄下來(lái)；檢測(cè)：檢測(cè)的原理基于被測(cè)組分和背景電解質(zhì)的吸光度不同，當(dāng)被測(cè)組分通過(guò)檢測(cè)窗時(shí)，吸光度發(fā)生的變化服從朗伯-比爾定律，即在定的實(shí)驗(yàn)條件下，吸光度與被測(cè)組分的濃度成正比。

毛細(xì)管電泳和普通電泳相比較的勢(shì)在哪里？

通常電流通過(guò)導(dǎo)體時(shí)都會(huì)產(chǎn)生焦耳熱。傳統(tǒng)平板凝膠電泳的大局限性在于，其無(wú)法克服兩端電壓帶來(lái)的焦耳熱所產(chǎn)生的負(fù)面影響。焦耳熱可使篩分介質(zhì)內(nèi)部出現(xiàn)溫度、粘度及分離速度的不均，影響遷移、降低效率、使區(qū)帶變寬。由于這種負(fù)面影響與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，所以大地限制了電壓的引入，也難以提電泳速度。毛細(xì)管電泳使樣品在根細(xì)的柱子中進(jìn)行分離。細(xì)柱可減小電流，使焦耳熱的產(chǎn)生減少；同時(shí)又增大了散熱面積，提散熱效率，大大降低了管中心與管壁間的溫差，減少了柱子徑向上的各種梯度差，保證了效分離。因此可以加大電場(chǎng)強(qiáng)度，達(dá)到100～200V/cm，**提分離質(zhì)量。

毛細(xì)管電泳主要用于哪些實(shí)驗(yàn)？

總的來(lái)說(shuō)，毛細(xì)管電泳可用于對(duì)有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)離子、中性分子、手性化合物、蛋白質(zhì)和多肽、DNA和核酸片段的分析。具體來(lái)說(shuō)，常見的應(yīng)用范圍有以下幾個(gè)方面：

（1）速DNA測(cè)序：由于人類基因組工程的提出，速DNA測(cè)序引起了廣泛注意，由于對(duì)核苷酸及其聚合物的分辨率，毛細(xì)管電泳在DNA測(cè)序中的應(yīng)用潛力也受到重視。在電場(chǎng)和使用陣列毛細(xì)管條件下，其潛在的測(cè)序能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了現(xiàn)有方法。

（2）手性分離現(xiàn)代社會(huì)中，手性分析常牽涉到人類生命、動(dòng)植物的生存和演化，在**研究和生產(chǎn)中也是必須考慮的問(wèn)題，研究證明手性手細(xì)管電泳是簡(jiǎn)單效的手性分析方法。手性應(yīng)用的研究包括異構(gòu)體拆分、能度測(cè)定、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究、手性**篩查等。

（3）蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)分離分析也是毛細(xì)管電泳的主要應(yīng)用方向，包括：蛋白和多肽的純度分析、結(jié)構(gòu)研究、結(jié)合蛋白的研究、生化及其過(guò)程分析、物化常數(shù)的測(cè)定，臨床醫(yī)學(xué)研究等。

（4）糖分析糖是自然界中廣泛存在的化學(xué)物質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)中90%以上含有糖堿基；糖在細(xì)胞識(shí)別以及其它生物分子識(shí)別中也具有不可替代的作用。但是由于糖的些特殊性質(zhì)，對(duì)它的分離分析有很大的困難。而近年發(fā)展起來(lái)的毛細(xì)管電泳儀用于糖的分析取得了巨大的成功，成為糖分離分析的有效工具。

（5）單細(xì)胞分析毛細(xì)管電泳既能研究許多細(xì)胞構(gòu)成的樣品，也能只研究單個(gè)細(xì)胞，即單細(xì)胞分析。單細(xì)胞分析技術(shù)為生命科學(xué)研究打開了新的天地，推動(dòng)了系列的新研究的出現(xiàn)，已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、**學(xué)、血液流變學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)，特別是腫瘤研究和器官移植。

（6）聯(lián)用技術(shù)聯(lián)用技術(shù)的研究將是毛細(xì)管電泳儀的重大發(fā)展方向之，與譜、質(zhì)譜等方法的聯(lián)用將會(huì)大大提毛細(xì)管電泳儀的應(yīng)用范圍。

毛細(xì)管電泳的基本操作

1．按照儀器操作規(guī)程開機(jī)，預(yù)熱，輸入毛細(xì)管卡套溫度、操作電壓、檢測(cè)波長(zhǎng)和沖洗程序等各項(xiàng)參數(shù)。緩沖液需過(guò)濾并脫氣。沖洗液、緩沖液等放置于樣品瓶中，依次放入進(jìn)樣器中。

2．毛細(xì)管處理的好壞對(duì)測(cè)定結(jié)果影響很大。未涂層的新毛細(xì)管要用較濃的堿液并在較高的溫度(例如1 mol/L氫氧化鈉溶液，60℃)沖洗，使毛細(xì)管內(nèi)壁活化生成硅羥基，再依次用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、水及緩沖液分別沖洗數(shù)分鐘。兩次進(jìn)樣中間可僅用緩沖液沖洗，當(dāng)分離性能改變時(shí)，必須用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液沖洗，甚至需要用濃氫氧化鈉溶液升溫沖洗。對(duì)于凝膠毛細(xì)管、涂層毛細(xì)管、填充毛細(xì)管電泳分析，應(yīng)按照所附說(shuō)明書進(jìn)行沖洗。沖洗時(shí)，應(yīng)將盛溶液的試樣瓶依次置于進(jìn)樣器中，設(shè)定順序和時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3．緩沖液的種類、pH和濃度，以及添加劑[提高待測(cè)組分的溶解度和(或)控制待測(cè)組分的解離度]的選擇對(duì)測(cè)定結(jié)果有顯著影響，應(yīng)照各品種項(xiàng)下的規(guī)定配制，并根據(jù)預(yù)試結(jié)果進(jìn)行調(diào)整、優(yōu)化。

4．將供試品溶液瓶置于進(jìn)樣器中，設(shè)定進(jìn)樣壓力(電動(dòng)進(jìn)樣電壓)、進(jìn)樣時(shí)間、正極端或負(fù)極端進(jìn)樣、操作電壓或電流、檢測(cè)器等操作參數(shù)，開始測(cè)試?？筛鶕?jù)預(yù)試或適用性試驗(yàn)的電泳譜圖調(diào)整儀器參數(shù)和緩沖液等參數(shù)優(yōu)化分析條件，然后采用優(yōu)化后的條件正式測(cè)試。

5.測(cè)試完畢后用水沖洗毛細(xì)管，注意將毛細(xì)管的兩端浸入水中保存，如果長(zhǎng)久不用應(yīng)將毛細(xì)管用氮吹干，后關(guān)機(jī)。

6．由于進(jìn)樣方法的限制，目前毛細(xì)管電泳的精密度比用定量閥進(jìn)樣的高效液相色譜法要差，故定量測(cè)定以內(nèi)標(biāo)法為宜。用加壓或減壓法進(jìn)樣時(shí)，供試品溶液的黏度會(huì)影響進(jìn)樣體積，應(yīng)使供試品溶液和對(duì)照溶液的黏度保持一致；用電動(dòng)法進(jìn)樣時(shí)，待測(cè)組分因電歧視現(xiàn)象及溶液離子強(qiáng)度會(huì)影響待測(cè)組分的遷移量，也是影響精密度的主要因素。

毛細(xì)管電泳方法的影響因素

(一)緩沖液的選擇

緩沖液的組成直接影響毛細(xì)管電泳分析的效果，緩沖液的種類、pH和濃度是為重要的影響因素。

緩沖液的種類應(yīng)遵循下列原則：

，在選擇的pH范圍內(nèi)具有良好的緩沖容量。

第二，在檢測(cè)波長(zhǎng)處的吸收低。

第三，自身淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流(焦耳熱)的產(chǎn)生。

在分離特殊性質(zhì)的成分時(shí)，可采用不同的分離模式，通過(guò)在緩沖液中添加環(huán)糊精、十二烷基硫酸鈉(SDS)可進(jìn)行手性物質(zhì)、中性物質(zhì)的分離。

緩沖液的pH可影響不同酸堿性的待測(cè)組分的遷移速率。當(dāng)緩沖液的pH低于組分的PI值時(shí)，組分帶正電，向陰極遷移，與電滲流同向，因此，組分遷移的總速度大于電滲流；當(dāng)緩沖液的pH高于溶液的PI值，情況相反，遷移的總速度低于電滲流。

緩沖液濃度的增加，使離子強(qiáng)度增加，能減少組分與和管壁、待測(cè)組分之間的相互作用，從而改善電泳分離效果。增加緩沖液的濃度提高柱效的同時(shí)，還應(yīng)考慮擴(kuò)散和黏度兩個(gè)因素。隨著緩沖液濃度的增大，分離電流也會(huì)上升，從而使焦耳熱的產(chǎn)量加大，可能影響分離過(guò)程。

(二)進(jìn)樣方法

主要有流體動(dòng)力進(jìn)樣和電動(dòng)進(jìn)樣兩種方式。

1．流體動(dòng)力進(jìn)樣流體動(dòng)力進(jìn)樣也稱虹吸進(jìn)樣、壓力進(jìn)樣或重力進(jìn)樣，是常用的進(jìn)樣方法。其優(yōu)點(diǎn)在于如果樣品的黏度和溫度保持恒定，則進(jìn)入毛細(xì)管的物質(zhì)量將是固定的；進(jìn)樣過(guò)程中沒有組分歧視效應(yīng)。但是流體動(dòng)力進(jìn)樣會(huì)引起雜質(zhì)干擾、柱效降低的缺點(diǎn)。

2．電動(dòng)進(jìn)樣電動(dòng)進(jìn)樣又稱電遷移進(jìn)樣，是通過(guò)改變進(jìn)樣電壓和時(shí)間能對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行控制的方法，進(jìn)樣量還與電泳淌度有關(guān)。因此，電遷移進(jìn)樣對(duì)遷移組分具有歧視效應(yīng)的缺點(diǎn)，對(duì)淌度較大的組分進(jìn)樣量會(huì)大一些，反之則要小一些。

(三)分離電壓

當(dāng)柱長(zhǎng)固定時(shí)，隨著操作電壓的增加，電滲流和電泳流速度的值都增加，使遷移時(shí)間縮短，但由于電滲流速度一般遠(yuǎn)大于電泳流速度，因此表現(xiàn)為組分的總遷移速度加快?？傊?，在一定的范圍內(nèi)柱效隨電壓的增加而增加，超過(guò)一定電壓時(shí)，隨著電壓的增加，焦耳熱的影響加劇，柱效反而下降。因此，在分析過(guò)程中可繪制電壓一柱效曲線，選擇佳的分離電壓。

(四)柱溫的選擇

溫度對(duì)遷移的影響可通過(guò)黏度體現(xiàn)，溫度升高，溶液的黏度降低，導(dǎo)致EOF增大。多數(shù)情況下，較高的溫度可縮短遷移時(shí)間。在流體動(dòng)力進(jìn)樣時(shí)，通過(guò)增加溫度可獲得更大的進(jìn)樣量。因?yàn)闇囟燃瓤捎绊懟瘜W(xué)平衡，又影響動(dòng)力過(guò)程，還能影響蛋白質(zhì)構(gòu)型及蛋白質(zhì)-DNA相互作用，因此可作為優(yōu)化分離的重要控制參數(shù)。

毛細(xì)管電泳儀的注意事項(xiàng)

(一)儀器工作環(huán)境

溫度一般為5～35℃，相對(duì)濕度一般小于65%。工作電壓為交流電源220V。

(二)儀器操作注意事項(xiàng)

1. 2ml緩沖溶液瓶的液面高度不得低于1/2，也不可超過(guò)瓶頸。且瓶口和瓶頸內(nèi)部不得沾有液體，如果有液體存在，應(yīng)將瓶口和瓶頸內(nèi)壁的液體清除再蓋瓶蓋；否則瓶蓋易滑出，從而導(dǎo)致毛細(xì)管及電極的折斷。瓶蓋上的液體殘留可能會(huì)導(dǎo)致漏電現(xiàn)象發(fā)生，當(dāng)發(fā)現(xiàn)緩沖溶液瓶瓶蓋上有液體時(shí)一定要立即清除或更換。

2．用于裝廢液的樣品瓶要及時(shí)清理，過(guò)量的廢液既會(huì)污染毛細(xì)管，也會(huì)造成氣路的阻塞。

3. 緩沖溶液瓶瓶蓋及樣品瓶瓶蓋均不可用洗滌劑長(zhǎng)時(shí)間浸泡或放入烘箱烘干，否則會(huì)導(dǎo)致瓶蓋的老化。此外，當(dāng)樣品瓶帽使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或被試劑腐蝕后，可能會(huì)出現(xiàn)失去彈性而變硬的情況，在此情況下應(yīng)更換使用新的瓶帽。

4．應(yīng)注意儀器的防塵、防潮，并經(jīng)常對(duì)電極和接口進(jìn)行清潔，避免因灰塵堆積造成漏電事故。